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本制品是一种简单、方便、快速地从培养的动物细胞或组织、植物、酵母、细菌或病毒等单个样品中分步分别提取RNA、基因组DNA和蛋白质的试剂盒。本试剂盒特别适合用于比较珍贵的样品，可以实现一个样品同时用于RNA、DNA和蛋白的抽提。本试剂盒不仅适用于少量样品的提取，还可用于大量不同样品的同时处理，特别适合同一个样品中RNA、DNA和蛋白质后续的同步检测。

本试剂盒抽提所得的RNA、DNA和蛋白质纯度高，用途广泛。抽提所得的总RNA无蛋白、DNA污染，溶于DEPC水或不含RNase的超纯水后的A260/280值为1.8～2.0，可直接用于RT-PCR、cDNA克隆、纯化mRNA、Northern blot、Dot blot、体外翻译、以及RNase protection assay等实验，也可以用于基因表达芯片分析、高通量测序等对RNA质量要求较高的实验；抽提所得的DNA适用于Southern杂交、基因组DNA的PCR扩增、基因组DNA的甲基化等修饰分析及基因组DNA文库的构建等实验；提取的蛋白可用于SDS-PAGE、Western blot、免疫沉淀等分析。

本试剂盒操作简单，使用便捷。本试剂盒操作简单快速，仅需约1小时即可完成RNA、DNA和蛋白质的提取。本试剂盒基于特殊裂解液多组分分离的原理，分步提取同一个样品的RNA、DNA和蛋白质。在样品中加入裂解液后进行裂解或匀浆，使细胞或组织充分裂解，加入氯仿混匀并离心后分为三层，包括上层无色水相(含RNA)，中间相(含DNA和蛋白质)和下层红色有机相(含DNA和蛋白质)。RNA溶于水相中，取出水相后用异丙醇沉淀即可获得纯化的RNA；用无水乙醇沉淀中间相和下层红色有机相的可溶物，可获得纯化的DNA；进一步用异丙醇沉淀有机相，可获得纯化的蛋白质。这些沉淀通过洗涤去除其它杂质成分后可用于后续的实验。

本试剂盒采用高品质抽提试剂。本试剂盒提供的特殊裂解液可以有效抑制RNA的降解，保持样品中RNA的完整性；既可用于小量样品(例如5～100mg组织或20～500万个细胞)，也适用于大量样品(例如大于1g的组织或超过一千万的细胞)。通常，每一百万细胞可抽提得到5～15μg RNA，每mg组织可抽提得到1～10μg RNA。

• 用户需自备无水异丙醇、氯仿、无水乙醇、DEPC水或无菌无酶超纯水。
  
• 第一次使用前，洗涤液I和洗涤液III需按下表加入指定量的无水乙醇，并做好标记☑。
  

  规格	洗涤液I		洗涤液III
  	原体积	加无水乙醇	原体积	加无水乙醇
  25T	22mL	+44mL	7.5mL	+112.5mL
  100T	88mL	+176mL	30mL	+450mL

• 所有离心管，枪头及相关溶液都必须无RNA酶污染。耐高温器物可150℃烘烤4小时以去除RNA酶，其它器物去除RNA酶可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后灭菌，烘干。
  
• 使用冻存的细胞或组织抽提总RNA的效果通常比新鲜的细胞或组织差一些。因为在细胞或组织冻融过程中一些细胞或组织内的RNase会被释放出来并剪切样品。如果不能及时抽提RNA，推荐先加入适量裂解液，并裂解样品后冻存。
  
• 必须戴一次性手套操作，且尽量不要对着RNA样品呼气或说话，以防RNA酶污染。建议戴一次性口罩操作。
  
• 裂解液含有毒物质，避免接触皮肤或吸入。为防止溅入眼睛，请戴防护眼镜或使用透明保护屏。如皮肤接触裂解液，请立即用大量去垢剂和水冲洗，如仍有不适，请听取医生意见。

• 准备工作：
  洗涤液I、洗涤液III第一次使用前需分别加入相应的无水乙醇，并做好标记☑。
  
• 样品的裂解：
  
  • 细胞裂解或组织匀浆。
    
    • 贴壁细胞：吸尽培养液，每10cm2细胞加入1mL裂解液。一般6孔板每孔加1mL裂解液，12孔板每孔加0.5mL裂解液。晃动3～5下，再用枪吹打2～3下，确保全部裂解，然后吸至离心管中。
      
    • 悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，每500～1000万动植物或酵母细胞，或1000万细菌，加入1mL裂解液。用枪吹打或适当Vortex，确保全部裂解。
      
      • 某些酵母和细菌如裂解不充分，可用匀浆器匀浆，以确保全部裂解。
    • 组织：先将组织剪切成小块，放入普通玻璃匀浆器内。每50～80mg组织加入1mL裂解液，匀浆。对于RNA完整性要求比较高的情况，推荐先液氮冷冻组织块，然后在低温下用研钵研碎组织，随后再加入裂解液进行总RNA抽提。
  • 对于某些蛋白，多糖或脂含量很高的细胞或组织，裂解液裂解后可能会有不溶物或油脂状漂浮物。需12000×g在4℃离心10分钟，然后吸取澄清的裂解液裂解产物至一新的离心管中。
    
  • 室温孵育5分钟，使样品充分裂解。
    
  • 按每毫升裂解液加入0.2mL氯仿，Vortex混匀或猛烈晃动15秒，室温孵育2～3分钟。
    
  • 12000×g在4℃离心15分钟。此时可见分层，分别为无色水相(上层)，中间层和红色有机相(下层)。其中上层无色水相用于RNA的提取(步骤3)，中间层和下层红色有机相分别用于DNA和蛋白质的提取(步骤4、5)。
• RNA的提取：
  
  • 吸取含总RNA的上层无色水相至一新的离心管中，每毫升最初的裂解液约可吸取0.5～0.55mL。
    
    • 不要吸到中间层和红色有机相(下层)。如果要分离DNA和蛋白质可保留这两部分，4℃可存放过夜。
  • 按每毫升最初的裂解液加入0.5mL无水异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀10分钟。如果希望提取microRNA等小RNA，推荐-80℃沉淀过夜。
    
  • 12000×g在4℃离心10分钟，在管底可见RNA沉淀，弃上清。
    
  • 每毫升最初的裂解液加入1mL洗涤液I，Vortex或颠倒混匀。
    
  • 7500×g在4℃离心5分钟，弃上清。再用离心机瞬时离心(>5000×g)，小心吸尽液体。
    
  • 待RNA略干后，加入20～50μL DEPC水或无菌无酶超纯水溶解，-80℃冻存。
    
    • 切勿让RNA过分干燥，否则将极难溶解，且测出的A260/280值会低于1.6。
• DNA的提取：
  
  • 接RNA提取步骤3a，尽可能去除上层的水相后，保留中间相和红色有机相(下层)。
    
  • 按每毫升最初的裂解液加入0.3mL无水乙醇，颠倒数次混匀。室温孵育2～3分钟。
    
  • 2000×g在4℃离心5分钟以沉淀DNA。如果需提取蛋白质，吸取上清至一新的离心管中，-80℃可存放1～2个月，操作步骤见步骤5。
    
  • 吸除上清后，用洗涤液II洗涤DNA沉淀，每毫升最初的裂解液加入0.8mL洗涤液II。室温孵育30分钟，期间轻柔颠倒混匀2～3次。
    
    • DNA在洗涤液II中2小时内稳定。
  • 2000×g在4℃离心5分钟，弃上清。
    
  • 重复步骤4d-e步骤一次。
    
    • 对于>200μg的DNA，步骤4d-e须重复两次，即共计3次。
  • 按每毫升最初的裂解液加入1.5mL洗涤液I洗涤DNA沉淀，室温孵育10～20分钟，期间轻柔颠倒混匀2～3次。
    
    • 加入洗涤液I的DNA沉淀在4℃可存放1～2个月。
  • 2000×g在4℃离心5分钟，弃上清。
    
  • 室温放置晾干DNA沉淀5～15分钟，无明显液体后，加入适量DNA溶解液溶解。可60℃温浴或适当增加DNA溶解液的量以促进DNA溶解。
    
    • 从50～70mg组织或10⁷个细胞中分离的DNA沉淀溶于300～600μL DNA溶解液，DNA的浓度通常为0.2～0.3μg/μL。
      
    • 提取的DNA沉淀可能不易溶于水和中性Tris缓冲液中。
      
    • 从某些样品(尤其是组织)中提取的DNA中可能包含一些胶状的不溶物，可12000×g在4℃离心10分钟去除。
• 蛋白的提取：
  
  • 接DNA提取步骤4c，取沉淀DNA后的上清。
    
  • 每毫升最初的裂解液加入1.5mL无水异丙醇，室温孵育10分钟。
    
  • 12000×g在4℃离心10分钟，弃上清。
    
  • 用洗涤液III洗涤蛋白质沉淀。每毫升最初的裂解液加入1mL洗涤液III，室温孵育20分钟。蛋白质在洗涤液III中，4℃可保存一个月，-20℃可保存一年。
    
  • 7500×g在4℃离心5分钟，弃上清。
    
  • 重复步骤5d-e 2～3次。
    
  • 按每毫升最初的裂解液加入1.5～2mL无水乙醇，Vortex混匀。室温孵育20分钟。
    
  • 7500×g在4℃离心5分钟，弃上清。
    
  • 室温放置晾干蛋白质沉淀5～10分钟，用200μL蛋白溶解液溶解蛋白质，反复吸打，可用50℃温浴使其完全溶解。
    
  • 10000×g在4℃离心10分钟去除不溶物。
    
  • 分离得到的蛋白质样品可用于下游实验或-20℃保存备用。